Product Description

Introduction

Kunci dari kit ini adalah sistem pengikatan DNA milik kami yang memungkinkan pengikatan DNA yang dapat dibalik dengan sangat efisien ke kolom mini sementara protein dan kotoran lainnya dihilangkan dengan penyangga pencuci. Asam nukleat kemudian dielusi dengan air steril atau buffer elusi. Plasmid yang diisolasi dengan protokol tradisional biasanya mengandung endotoksin tingkat tinggi (lipopolisakarida atau LPS). Untuk transfeksi jalur sel sensitif endotoksin atau injeksi mikro, endotoksin harus dibuang sebelum aplikasi. Sistem endofree EZgeneTM menggunakan buffer yang diformulasikan secara khusus yang mengekstrak endotoksin dari DNA plasmid. Ekstraksi dua putaran akan menurunkan tingkat endotoksin menjadi 0,1 EU (Endotoksin) per µg DNA plasmid. Kit miniprep plasmid ujung tiga menyediakan langkah pembuangan endotoksin yang efisien ke dalam prosedur pemurnian tradisional untuk menghasilkan DNA plasmid tingkat transfeksi. Kit ini dirancang untuk pemurnian DNA plasmid yang cepat dan efisien dari 3 hingga 12 mL kultur E. coli. Kolom mini memiliki kapasitas pengikatan DNA 80 µg. Endofree DNA yang dimurnikan siap untuk aplikasi hilir seperti transfeksi jalur sel sensitif endotoksin, sel biakan primer atau injeksi mikro.

Important Notes

Nomor Salinan Plasmid: Hasil DNA plasmid tergantung pada asal replikasi dan ukuran plasmid. Protokol dioptimalkan untuk pemurnian plasmid nomor salinan tinggi. Untuk plasmid dengan jumlah salinan rendah, volume kultur dan volume buffer perlu ditingkatkan 2 kali. Silakan lihat Tabel 1 untuk plasmid yang umum digunakan.

Table 1 Commonly used plasmid and expected yield.

Strain Inang: Strain yang digunakan untuk menyebarkan plasmid memiliki pengaruh yang signifikan terhadap hasil. Strain inang seperti Top 10, dan DH5a menghasilkan DNA plasmid berkualitas tinggi. strain endA + seperti JM101, JM110, HB101, TG1 dan turunannya, biasanya memiliki hasil plasmid yang rendah karena endonuklease endogen atau karbohidrat tinggi yang dilepaskan selama lisis. Kami merekomendasikan untuk mengubah plasmid menjadi strain akhir jika hasil tidak memuaskan. Silakan lihat Tabel 2 untuk informasi akhirA.

Table2 endA strains of E. Coli.

Massa Sel Optimal (OD600 x mL Kultur): Prosedur ini dirancang untuk mengisolasi plasmid yang ditumbuhkan dalam media LB standar (Luria Bertani) selama 12 -16 jam dengan kepadatan OD600 2.0 hingga 3.0. Jika media kaya seperti TB atau 2xYT digunakan, pastikan kepadatan sel tidak melebihi 3.0 (OD600). Rasio tinggi biomassa di atas buffer lisis menghasilkan hasil dan kemurnian DNA yang rendah. Kolom mini memiliki biomassa optimal 10-15. Misalnya, jika OD600 adalah 3,0, volume kultur optimal harus 1-5 mL.

Volume Kultur: Gunakan labu atau tabung dengan volume 4 kali lebih besar dari media kultur untuk memastikan kondisi optimal untuk pertumbuhan bakteri. Jangan melebihi volume kultur maksimum yang disarankan dalam protokol. Lisis yang tidak lengkap karena jumlah kultur bakteri yang berlebihan menghasilkan hasil yang lebih rendah dan kemurnian yang lebih rendah.